研究人员来自第三军医大学西南医院的唐康来、郭林、陈玉佳男，第三军医大学的缪洪明以及纽约大学的刘传聚，联手在《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊上发表了研究论文《Malate initiates a proton-sensing pathway essential for pH regulation of inflammation》（影响因子：408）。该研究揭示了三羧酸循环中的中间体L-苹果酸如何通过直接结合免疫球蛋白（BiP）来抑制BiP与干扰素调节因子2结合蛋白2（IRF2BP2）的相互作用，进而保护IRF2BP2不被BiP驱动的降解，显示出该分子在体外和体内对炎症反应的抑制作用。

研究表明，pH值的降低促进了L-苹果酸羧基的质子化，从而增强了L-苹果酸与BiP的结合，且这种结合以羧基依赖的方式抑制了BiP与IRF2BP2的相互作用。在巨噬细胞中，BiP-IRF2BP2信号通路对pH值变化高度敏感，能够介导抗酸化炎症及细胞内pH碱化剂诱导的促炎作用。此外，小鼠结肠中的局部碱化通过骨髓BiP的依赖性方式诱导结肠炎，并降低了IRF2BP2的蛋白质水平。在该研究中，研究团队使用了汉恒生物提供的HBLV-U6-gRNA-EF1-CAS9-PURO慢病毒载体，敲除了Raw2647细胞中的Hspa5和Mdh2基因，构建了Hspa5+/-和Mdh2-/-细胞系。

首先，作者通过脂多糖（LPS）刺激的骨髓衍生巨噬细胞（BMDM）模型筛选了38种可溶性能量代谢中间体，发现L-苹果酸在抑制炎症因子如Il1b、Tnf和Il6的表达方面具有显著效果。通过ELISA进一步验证了L-苹果酸对IL-6和TNF-α的抑制作用，并使用Western blot确认L-苹果酸可以抑制IL-1β前体（pro-IL-1β）的表达。为了检验L-苹果酸的内源性增加是否调节炎症反应，作者在Raw2647细胞系中敲除了苹果酸脱氢酶2（Mdh2），发现其敲除增加了细胞内苹果酸水平，并减弱了LPS诱导的促炎细胞因子表达。在体内实验中，L-苹果酸的给药（200或400 mg/kg）显著提高了LPS急性炎症模型小鼠的存活率，而在胶原抗体诱导的关节炎小鼠模型中，L-苹果酸减少了爪肿胀、关节破坏及临床评分，有效减轻了疾病的严重程度。

多项研究表明，糖酵解是LPS诱导Il1b表达的必要条件，但早期实验结果显示，L-苹果酸并不影响LPS刺激下的巨噬细胞糖酵解，这意味着L-苹果酸的抗炎作用并非依赖于代谢。因此，作者利用药物亲和反应靶向稳定性（DARTS）试验分析了L-苹果酸诱导的抗炎作用的潜在分子机制，发现受到L-苹果酸处理保护的蛋白中，结合免疫球蛋白（BiP又称Grp78、HspA5）的含量显著增加。表面等离子共振（SPR）实验则表明L-苹果酸能够与重组BiP蛋白或细胞内源的完整BiP直接相互作用。

在活化的BMDM中，缺乏BiP的细胞在LPS刺激后期显著下调pro-IL-1β的表达，且直接添加L-苹果酸或在胞外pH控制条件下添加L-苹果酸（培养基pH 6.9）均抑制了Il1b的水平。在LPS致死小鼠模型中，通过BiP骨髓特异性敲除实验发现，L-苹果酸增强的存活率被完全抵消。此外，L-苹果酸对BiP-IRF2BP2的直接结合影响同样显著，能够有效阻断两者之间的相互作用，并且L-苹果酸与IRF2BP2无直接结合关系。

与此同时，研究进一步探索了L-苹果酸是否影响BiP与相关配体的结合。蛋白质微阵列结果显示，IRF2BP2对BiP的结合表现出了最强的信号和灵敏性。在L-苹果酸处理的LPS BMDM模型中，RNA-seq分析显示地塞米松是预测到的发生转录改变的5个上游调控因子之一，且相关基因参与了“PD-1/PD-L1癌症免疫治疗通路”和“糖皮质激素受体信号转导”通路，而IRF2BP2作为GR和NF-κB的共同调节因子，可能与L-苹果酸的抗炎作用相关。

在该研究中，作者也详细探讨了L-苹果酸-BiP轴如何通过靶向IRF2BP2的蛋白水解来调节炎症反应。经过一系列实验，表明L-苹果酸能够增加IRF2BP2的蛋白水平，而不影响其mRNA水平。此外，BiP诱导剂如衣霉素和毒胡萝卜素能够显著降低LPS刺激后的IRF2BP2蛋白丰度，这种效应与IRF2BP2的缺失有明确的关联。

最后，研究阐明了pH值变化对BiP-IRF2BP2信号传导的影响，并指出该信号通路在调节IL-1β产生中的作用。在小鼠模型研究中，直肠给予NaOH后引起小肠绒毛损伤及炎性细胞因子的上调，而骨髓缺失BiP则消除了结肠炎的表型。结合以上实验结果，研究者指出，在维持质子依赖性肠道免疫平衡中，BiP-IRF2BP2信号通路发挥了重要作用。

综上所述，这项研究揭示了L-苹果酸作为细胞质pH感应分子的潜在机制，阐明了通过调控BiP-IRF2BP2信号通路来控制炎症介质的表达，开辟了通过调节细胞内pH或靶向BiP-IRF2BP2信号通路治疗炎症相关疾病的新策略，充分展示了Z6·尊龙凯时在生物医疗领域的应用前景。