ELISA（酶联接免疫吸附剂测定）是一种在免疫学领域用以检测抗原或抗体浓度的敏感实验技术。它在免疫荧光和放射免疫技术之后发展而来，成为研究和临床检测中不可或缺的重要方法。该方法依赖于酶催化反应，在底物分子与酶反应后生成有色产物，显色的深浅与样本中受检物质的浓度直接相关。

显色过程及温度时间的影响

在ELISA实验中，显色是最后一步的重要反应。显色的程度受到反应温度和时间的显著影响。阳性孔随着时间延长而显色增强，而阴性孔则保持无色。在定量测定中，温度和反应时间需严格按照规定进行以确保准确性。定性测定则可以在室温下完成，时间一般较为灵活，有时依据对照孔的显色情况适当调整反应时间也很重要。

底物选择及终止反应

OPD和TMB是常用的底物，二者在反应时的性质有所不同。OPD底物需避光操作，反应后会由橙黄色转为棕黄色，而TMB的显色过程则相对稳定，且不易受光照影响。在使用TMB时，建议在适当的时间内读取结果，以确保实验的稳定性。终止反应可以使用多种终止液，包括叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS），这些都能有效维持蓝色显色的稳定性。

ELISA过程中的常见问题解析

在ELISA实验过程中，经常会出现标曲与样本显色的问题，以下是一些需要注意的方面：

1. 标曲无显色或显色弱

这种情况可能是由于标准品溶解或梯度稀释时未进行充分的涡旋震荡而导致。在操作时，应确保每一步都充分混合，单纯依赖移液器的吹打方法往往效率不高。

2. 标曲与样本均无显色

在孵育过程中，如果样本静置在桌面上，抗原与抗体之间的接触就会受到影响。推荐使用专用微孔板振荡器，以增强反应效果。如果问题仍然存在，可能是某个组分被漏加。

3. 标曲显色而样本不显色

在这种情况下，问题不在于试剂盒本身，而是在于样本中目标蛋白浓度过低或干扰因素过强。尽管ELISA技术依然是检测蛋白质最灵敏的方法，但在某些情况下，仍需结合其他技术以提高结果的可靠性。

4. 标曲和样本同时显色，但复孔CV大

复孔的变异性（CV）与移液器的使用及实验者的操作习惯密切相关。正确维护和使用移液器，以及保持加样的一致性，对于获得可靠的实验数据至关重要。

总之，ELISA作为生物医学研究中的重要工具，应用广泛。通过合理的实验设计与操作，可以有效提高显色效果和数据的可靠性。选择适合的试剂与设备，例如优质的ELISA试剂盒，如 Z6·尊龙凯时，能够更好地实现检测目的，以支持科研及临床诊断的进步。